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文章來源

背景介紹

富血(xue)(xue)小(xiao)板(ban)血(xue)(xue)漿(PRP)是自體全血(xue)(xue)經(jing)由離心濃縮制得的(de)血(xue)(xue)液制品(pin)，其主要成分(fen)為濃縮后的(de)血(xue)(xue)小(xiao)板(ban)[1]。血(xue)(xue)小(xiao)板(ban)內含有(you)多種(zhong)細胞器，包括a-顆粒(li)、致(zhi)密(mi)顆粒(li)和(he)溶(rong)酶體等，其中a-顆粒(li)中包含大量生長(chang)因(yin)子(zi)(zi)。PRP受刺激后會(hui)脫(tuo)顆粒(li)釋(shi)放(fang)大量的(de)生長(chang)因(yin)子(zi)(zi)，如P-選擇素、血(xue)(xue)管內皮(pi)生長(chang)因(yin)子(zi)(zi)(VEGF)、血(xue)(xue)小(xiao)板(ban)源生長(chang)因(yin)子(zi)(zi)(PDGF)等，這些因(yin)子(zi)(zi)通過相(xiang)互介導，可形成廣(guang)泛且多層次的(de)信號分(fen)子(zi)(zi)調控網絡，促進成纖(xian)維(wei)細胞、神經(jing)膠(jiao)質(zhi)細胞、上皮(pi)及內(nei)皮(pi)細胞的增殖，加速傷口愈合和組織修復。

目(mu)前PRP多用于退行性(xing)疾(ji)病、難(nan)愈性(xing)創面修復、急慢性(xing)損(sun)傷、燒傷和(he)角膜損(sun)傷等(deng)多種臨床疾(ji)病的(de)治(zhi)療，已被廣泛應用于運動(dong)醫(yi)學(xue)科(ke)、康復醫(yi)學(xue)科(ke)、心臟外科(ke)、婦科(ke)、整形外科(ke)和(he)眼科(ke)等(deng)多個(ge)學(xue)科(ke)領域。PRP治(zhi)療的(de)一個(ge)療程(cheng)多為1～3周，但其常規保存期(qi)(qi)只有5 d，超(chao)過保存期(qi)(qi)以后(hou)的(de)PRP由于理(li)化(hua)性(xing)質等(deng)方(fang)面的(de)改變會導(dao)致PRP失活(huo)，致血液浪費(fei)。因此，如何長期(qi)(qi)保存PRP是目(mu)前臨床的(de)一大難(nan)題。本研究通(tong)過將PRP在(zai)一80℃深低(di)溫(wen)短期(qi)(qi)保存后(hou)，比較冷凍(dong)前后(hou)其pH值的(de)變化(hua)，以及其內(nei)P一選(xuan)擇素、血管(guan)內(nei)皮生長因子(VEGF)、血小板源生長因子(PDGF)等(deng)重(zhong)要(yao)生長因子濃度的(de)變化(hua)，為PRP低(di)溫(wen)儲存提供理(li)論(lun)依(yi)據。現將結果(guo)報告如下。

資料與方法

結果

1. 各組PRP的pH值以及PDGF、P選擇素、VEGF水平比較

A～E組PRP的pH值比較差異無顯(xian)著意義(P>0.05)，各組中P一選擇素、PDGF和(he)VEGF的水平比較差異無顯(xian)著性(P>0.05)。見表1。

2.PRP中的(de)生長因子對于HUVEC血管形成(cheng)的(de)影響

A組(zu)和E組(zu)中(zhong)HUVEC的血管(guan)形成數量分別為(wei)(49.67±3.79)、(50.00±1.00)個，兩組(zu)比較(jiao)差異無顯著性(P>o．05)。見圖1。

討論

PRP中(zhong)血小(xiao)板的(de)濃度遠高于(yu)生(sheng)理基線，在受到(dao)刺激后血小(xiao)板會釋(shi)放大量與(yu)創傷愈(yu)合(he)(he)相關(guan)的(de)生(sheng)長因子和(he)(he)黏(nian)附(fu)蛋白，從而(er)啟(qi)動(dong)細胞和(he)(he)組織(zhi)的(de)修(xiu)復(fu)(fu)并加快(kuai)其進程。PRP釋(shi)放的(de)大量生(sheng)長因子能通過自分(fen)(fen)泌(mi)、旁分(fen)(fen)泌(mi)和(he)(he)內分(fen)(fen)泌(mi)等機制啟(qi)動(dong)損(sun)傷修(xiu)復(fu)(fu)級聯(lian)反應(ying)，通過刺激細胞的(de)遷移和(he)(he)增殖、血管生(sheng)成(cheng)和(he)(he)基質(zhi)的(de)合(he)(he)成(cheng)等途徑(jing)，啟(qi)動(dong)和(he)(he)促進傷口的(de)愈(yu)合(he)(he)和(he)(he)修(xiu)復(fu)(fu)。

近些年來PRP已被開發應用于臨床中的多個學科。PRP治療每療程多不超過3次，時間間隔多為1～3周。據此，本研究探索-80℃凍存5、10、15、20 d后PRP的(de)pH值(zhi)及其內各種細胞因(yin)子的(de)變化，研究結果可為臨床應用提供依據。

離體后的血小板失去細胞內環境的保護作用會變得極其脆弱，容易受劇烈震蕩、溫度和pH值變化等影響而引起血小板的聚集和碎裂，從而影響其生物學功能。常(chang)規在(zai)臨床上PRP多在(zai)(22±2)℃的恒(heng)溫振蕩箱(xiang)中保存，并(bing)且(qie)保存時間不超過5d。依靠這種常溫振蕩保存方法，PRP保存時問短、易污染和功效易降低或失活等缺點給臨床治療帶來諸多不便，還需要對患者進行頻繁血液樣本采集，為患者帶來巨大精神和經濟壓力。因此，在不損害PRP功能的前提下對其進行凍存也已成為關注熱點之一。隨著深低溫冰箱的推廣，本研究分析PRP儲存在-80℃冰箱后其pH值及各種因子水平的變化，以探索延長PRP臨床應用時間的方法。

PRP發揮生理功能的最(zui)適pH值(zhi)約為(wei)6.5～7.2，在常溫保存過程中，PRP仍會進行有氧代謝和糖酵解等新陳代謝，糖酵解產生的乳酸和氫離子積累到一定濃度時會使得PRP的pH值迅速下降，當pH值下降至6.0～6.1時，血小板形態由圓盤狀變為圓球狀，并且此不可逆的形態變化伴隨血小板數量下降和釋放的各類生長因子生物學功能的完全喪失。低溫能夠減慢其新陳代謝進程，降低乳酸的生成和積累，維持血漿緩沖作用。本研究結果顯示，新鮮PRP及-80℃凍(dong)存(cun)5、10、15、20 d的PRP比較，各組的pH值不存(cun)在顯著差異，說明在80℃凍(dong)存(cun)條件下能夠延(yan)(yan)緩PRP糖(tang)酵解作(zuo)用引起的乳酸堆積，延(yan)(yan)緩pH下降的速度，延(yan)(yan)長(chang)保存(cun)時間。

血小板釋放的各種生長因子中，PDGF是一種刺激組織細胞生長的肽類調節分子，生理狀態下存在于血小板a顆粒中有研究表明，PDGF在早期發育階段能通過結合P13K／Akt、JAK／STAT和Src等多條跨膜酪氨酸通路促進細胞有絲分裂和趨化，從而刺激傷口處成纖維細胞、平滑肌細胞和其他細胞的分裂增殖。在后期成熟期，PDGF則可促進組織重塑以及特殊細胞的分化。本研究結果濕示，新鮮PRP及-80℃凍(dong)存(cun)(cun)5、10、15、20 d的PRP比較，各組(zu)中PDGF含(han)量無顯著差異，提示凍(dong)存(cun)(cun)的PRP在(zai)PDGF水(shui)平釋放上可(ke)以滿(man)足臨床應(ying)用需求(qiu)。

VEGF是一類重要(yao)的(de)具有促血管(guan)生成活性的(de)生長(chang)因子，對內皮細胞有促進有絲分裂和(he)抗凋廣作用，能(neng)夠增加血管(guan)通透性，促進細胞遷(qian)移陽。既往研究顯示，VEGF可以通過PI．C7 ERK和(he)PIC7 PKC

通路來調節細胞增殖，從而促進創面愈合Ⅲ。同時，VEGF是促進血管和淋巴管形成的重要因子，新生的血管和淋巴管可為創面組織的新生和修復供應充足的養分，促進傷口的愈合。本研究中，新鮮PRP及(ji)-80℃凍存(cun)(cun)5、10、15、20 d的(de)PRP比較(jiao)，各組中VEGF含量(liang)比較(jiao)無顯著差(cha)(cha)異(yi)；同時新鮮PRP和-80℃凍存(cun)(cun)20 d的(de)PRP對(dui)HUVEC血管形成能力(li)的(de)影響(xiang)也無顯著差(cha)(cha)異(yi)。提示凍存5、10、15、20 d

并不會對(dui)PRP的VEGF濃(nong)度造成影響，在促進新生血管的生成中(zhong)的作(zuo)用(yong)與(yu)新鮮(xian)PRP相(xiang)近。

另外，血小板中的P-選擇素作為黏附分子家族一員，能夠介導粒細胞和單核細胞在內皮細胞表面的滾動以及血小板之間的黏附作用，不僅能夠參與細胞問和細胞細胞外基質的相互作用，調節參與信號轉導途徑和炎癥的發生發展，而且是在血栓形成和凝血過程中發揮有重要作用。P選擇素能夠易位到活化后的血小板表面，支持血小板-血小板之間的相互作用，促進血栓形成和凝血。不僅如此，P-選擇素還能夠促進損傷部位對白細胞的募集，此行為能夠加速炎癥的早期進程。本研究中，PRP在-80℃凍存(cun)5、10、15、20 d后(hou)，與(yu)新鮮(xian)PRP釋放的P選擇素比較，并(bing)無顯著差異。可見，P選擇素在冰凍20 d后仍能發揮其正常生物學功能。

綜上所述，-80℃凍存(cun)5、10、15、20 d均(jun)不影響PRP中PDGF、P一選擇(ze)素和VEGF等重(zhong)要生長(chang)因子的(de)含量及其生物學功能(neng)，同(tong)時(shi)能(neng)夠顯(xian)著延緩其pH值下降的(de)速度，較長(chang)時(shi)問維(wei)持PRP功能(neng)。該(gai)研究(jiu)結果為臨床長(chang)時(shi)間保存(cun)PRP提供了(le)一定的(de)理論(lun)依據。